微納尺度物質(zhì)的分離和分選在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)和單細(xì)胞分析等研究中至關(guān)重要。精準(zhǔn)、高效和快速的分離微納尺度物質(zhì)能夠?yàn)榘┌Y的早期診斷、生物樣品檢測(cè)和細(xì)胞篩選提供重要幫助,其中基于外加場(chǎng)分離技術(shù)的分離微納尺度物質(zhì)因可以對(duì)微納尺度物質(zhì)高效在線分離和分選,被廣泛應(yīng)用于微納米顆粒、外泌體以及生物細(xì)胞的分離工作中,而目前多數(shù)外加場(chǎng)分離技術(shù)存在裝備繁瑣和樣品消耗大等問題。微流控技術(shù)是一種通過制作微通道和微流控芯片操縱微小流體對(duì)微納尺度樣品組分進(jìn)行分離的技術(shù),因具有快速檢測(cè)、高通量、在線分離、集成性高、成本低等優(yōu)勢(shì)現(xiàn)被應(yīng)用于微納尺度物質(zhì)分離分析中,是一種微納尺度物質(zhì)分離的有效方法,通過在微流控芯片上設(shè)計(jì)不同的通道及外部配件提高主動(dòng)場(chǎng)對(duì)微納尺度物質(zhì)分離效率。外加場(chǎng)分離技術(shù)與微流控技術(shù)聯(lián)用可以實(shí)現(xiàn)微納尺度物質(zhì)的無損、高效、在線分離。該綜述主要概述了近年來在微流控芯片上依托流動(dòng)場(chǎng)、電場(chǎng)、磁場(chǎng)及聲場(chǎng)等外加場(chǎng)分離技術(shù)來提高對(duì)微納尺度物質(zhì)分離效率的研究現(xiàn)狀,并將各個(gè)外力場(chǎng)對(duì)單細(xì)胞、微顆粒等微納尺度物質(zhì)的分離進(jìn)行分類介紹,總結(jié)各自的優(yōu)缺點(diǎn)及發(fā)展應(yīng)用,最后展望了外加場(chǎng)分離技術(shù)與微流控技術(shù)聯(lián)用在應(yīng)用于癌細(xì)胞的早期篩查、精確分離微尺度物質(zhì)領(lǐng)域的未來發(fā)展前景,并提出聯(lián)用技術(shù)的優(yōu)勢(shì)和未來應(yīng)用等。

微納尺度物質(zhì)的分離分選在生命科學(xué)、材料科學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域中至關(guān)重要,分離微納尺度物質(zhì)將在靶標(biāo)篩查、個(gè)體化差異、新藥開發(fā)、個(gè)體化精準(zhǔn)治療等方面具有巨大意義。目前,主要根據(jù)微納尺度物質(zhì)表面的物理化學(xué)性質(zhì)如尺寸、形狀、電荷、質(zhì)量等不同對(duì)其進(jìn)行分離分選?，F(xiàn)有的分離微納尺度物質(zhì)方法可以分為兩大主流。一種是基于目標(biāo)物尺寸差異在通道和流體的共同作用下的路徑不同,從而實(shí)現(xiàn)分離的被動(dòng)式分離技術(shù),如確定性側(cè)向位移、慣性聚焦、超濾法、離心法等。雖然被動(dòng)式分離技術(shù)取得了一定進(jìn)展,但其普遍存在分離度低、易堵塞通道、難以實(shí)現(xiàn)在線分離檢測(cè)的問題。第二種分離方法是根據(jù)混合目標(biāo)物中不同目標(biāo)物所具有的物理化學(xué)性質(zhì)不同,通過添加不同的外力場(chǎng)使目標(biāo)物在分離系統(tǒng)內(nèi)部的運(yùn)動(dòng)行為發(fā)生改變,從而實(shí)現(xiàn)分離的主動(dòng)式分離技術(shù),外加力場(chǎng)類型有電場(chǎng)、磁場(chǎng)、流場(chǎng)及聲場(chǎng)等,這些主動(dòng)式分離技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)微納尺度物質(zhì)的在線分離和分選,并且在微顆粒、外泌體、病毒及單細(xì)胞分離工作中展現(xiàn)出重要的作用。然而如何使這些分離技術(shù)小型化、集成化、易操作仍然是現(xiàn)今待解決的問題。

微流控技術(shù)也被稱為芯片實(shí)驗(yàn)室,起源于1990年Manz等提出的“微全分析系統(tǒng)”,指的是通過制作微管道或微流控芯片來操縱微小流體并對(duì)微尺度物質(zhì)樣品組分進(jìn)行分離的技術(shù),是一種主要針對(duì)微納尺度物質(zhì)分離的有效方法。微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)微納尺度物質(zhì)的精準(zhǔn)、高通量、在線分離,可以用最少的試劑、時(shí)間和成本完成分離任務(wù)且具有微型化、集成化、成本低廉、高通量等特征。隨著微流控技術(shù)的發(fā)展,利用微納尺度物質(zhì)的不同性質(zhì),制作特殊結(jié)構(gòu)的微流控芯片裝置,以提高對(duì)微納尺度物質(zhì)的分離效率,更具有針對(duì)性,微流控芯片的生物相容性提高了其在生物細(xì)胞操作和分析中的應(yīng)用,同時(shí)在微流控技術(shù)方面可以使復(fù)雜分析方案合理化,顯著減少樣品體積和試劑成本,在處理微量樣品時(shí)具有降低成本、降低危害、提高分辨率等優(yōu)勢(shì)。隨著微流控技術(shù)對(duì)微納尺度物質(zhì)分離發(fā)展的不斷增長(zhǎng)與進(jìn)步,針對(duì)細(xì)胞、顆粒物等微納尺度物質(zhì)的分離在醫(yī)療領(lǐng)域、生物化學(xué)領(lǐng)域等起到了至關(guān)重要的作用。利用這些優(yōu)勢(shì)可以將基于外加場(chǎng)的分離技術(shù)與微流控技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用,制備所需的微流控芯片,針對(duì)不同特性的樣品施加外部力場(chǎng),比如電場(chǎng)、磁場(chǎng)及聲場(chǎng)等來對(duì)混合樣品組分進(jìn)行精準(zhǔn)分離。

本文主要概述了在微流控芯片上依托流動(dòng)場(chǎng)、電場(chǎng)、磁場(chǎng)及聲場(chǎng)的主動(dòng)分離技術(shù)來提高分離效率的研究現(xiàn)狀,并探討對(duì)生物細(xì)胞的富集與混合顆粒物的有效精準(zhǔn)分離的發(fā)展與應(yīng)用。

1 流場(chǎng)場(chǎng)流分離技術(shù)

流場(chǎng)場(chǎng)流分離技術(shù)是各種場(chǎng)流分離技術(shù)中使用最通用的一種技術(shù),其中非對(duì)稱流場(chǎng)流分離技術(shù)是1987年由Wahlund和Giddings提出的一種流場(chǎng)分餾技術(shù),目前被廣泛應(yīng)用。該技術(shù)將非特異性的相互作用減少到最低限度,并具有分辨率高的優(yōu)點(diǎn),在FIFFF通道內(nèi),外加力場(chǎng)為垂直于流道方向的橫向流,樣品在橫向流的驅(qū)動(dòng)下與自身擴(kuò)散力之間達(dá)到一個(gè)平衡,各組分在通道內(nèi)壁上產(chǎn)生分布差異,其中,小尺寸樣品在積聚壁上形成的分布層要高于大尺寸顆粒,這時(shí)流動(dòng)場(chǎng)在通道內(nèi)流動(dòng)時(shí),分布層較高的小尺寸顆粒要比大尺寸顆粒更早的洗脫,從而實(shí)現(xiàn)分離。FIFFF沒有固定相,對(duì)樣品施加的剪切力和機(jī)械應(yīng)力較小,使它成為一種溫和的分離技術(shù),現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于分離和表征不同尺寸和不同形狀的顆粒、細(xì)胞、蛋白質(zhì)或DNA等物質(zhì)。

Dou等利用非對(duì)稱流場(chǎng)流分離技術(shù)在線耦合紫外、多角度光散射和熒光探測(cè)器對(duì)蛋黃血漿進(jìn)行分離和表征。利用蛋黃血漿作為AF4的載體液,評(píng)價(jià)了AF4對(duì)蛋黃血漿中的可溶性蛋白、低密度脂蛋白及其聚集物進(jìn)行高效快速分離和表征的實(shí)用性。同時(shí)研究了低密度脂蛋白在卵黃血漿中的聚集行為,利用程序交叉流的AF4具有提高檢測(cè)能力、降低樣品消耗和減少分析時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)果證明,AF4適用于尺寸分布范圍較大目標(biāo)物的分離和表征,如蛋黃血漿。該團(tuán)隊(duì)還利用AF4結(jié)合多角度光散射和差分折射探測(cè)器對(duì)淀粉的分離和表征進(jìn)行了深入研究,為今后更好地研究淀粉結(jié)構(gòu)-功能的關(guān)系提供重要信息。

Ashby等利用流場(chǎng)場(chǎng)流分離技術(shù)結(jié)合離心分離技術(shù),建立了一種基于相對(duì)解離率的冠狀蛋白鑒定方法,用來篩選納米顆粒和蛋白質(zhì)之間的相互作用。該方法將超順磁氧化鐵納米顆粒和免疫球蛋白G(lgG)在人血清中進(jìn)行孵育,再利用F4和離心法分離出與SPION親和力較好的蛋白質(zhì),F4以較快的速度洗去與納米顆粒相互作用的蛋白質(zhì),解決了當(dāng)納米粒子進(jìn)入到生物基質(zhì)時(shí),基質(zhì)表面形成的蛋白冠對(duì)納米粒子在生物系統(tǒng)中的后續(xù)行為影響,有助于研究蛋白質(zhì)冠的時(shí)間分布及其在生物基質(zhì)中的演化,以及高通量分析蛋白質(zhì)冠與粒子特性相關(guān)的動(dòng)態(tài)特征。

Adkins等將納米顆粒跟蹤技術(shù)與AF4耦合得到AF4-NTA技術(shù),彌補(bǔ)了NTA在線檢測(cè)器存在檢測(cè)范圍窄、流量小和壓力閾值低等問題。AF4-NTA作為一項(xiàng)對(duì)混合物中不同粒子數(shù)的納米材料進(jìn)行高效精確粒子計(jì)數(shù)的技術(shù),利用合理的分流設(shè)計(jì),對(duì)尺寸為50、100和200 nm的聚苯乙烯混合物進(jìn)行分離分析,同時(shí)在線對(duì)混合物中不同納米尺寸目標(biāo)物進(jìn)行精確地顆粒計(jì)數(shù)。

目前,AF4在不斷地進(jìn)步與發(fā)展,無論在化學(xué)分離領(lǐng)域或者生命科學(xué)等其他重要領(lǐng)域都顯示出了巨大的潛力,它可以利用溫和分離且裝置結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等特性,與不同的檢測(cè)器進(jìn)行耦合,為生物治療和納米顆粒分離表征提供技術(shù)支持。在未來,AF4溫和分離特性優(yōu)勢(shì)與微流控的通道小型化、節(jié)約試劑和節(jié)約樣品成本的優(yōu)勢(shì)相結(jié)合,成為一種高度靈活和具備高分辨率的分離技術(shù),具有巨大的發(fā)展前景。

2 基于外加電場(chǎng)的分離技術(shù)

近年來,越來越多的科學(xué)家利用電場(chǎng)對(duì)微納尺度物質(zhì)進(jìn)行分離分析。主要分離原理是根據(jù)目標(biāo)物尺寸、大小和帶電荷量等特性的不同,通過調(diào)節(jié)電參數(shù)使其在分離系統(tǒng)內(nèi)的運(yùn)動(dòng)行為發(fā)生變化,達(dá)到對(duì)生物細(xì)胞和顆粒物等微納尺度物質(zhì)的操縱與分離。常見的外加電場(chǎng)的分離方法分為4種(見圖1),分別為毛細(xì)管電泳、介電泳、電場(chǎng)場(chǎng)流分離、電滲驅(qū)動(dòng)。

圖1   目前被廣泛使用的4種電場(chǎng)分離技術(shù)

2.1 毛細(xì)管電泳

根據(jù)在一定的電場(chǎng)作用下帶電粒子在介質(zhì)中定向遷移的性質(zhì),利用毛細(xì)管電泳技術(shù)在兩端施加高壓電場(chǎng)對(duì)微納尺度物質(zhì)的分離分析滿足當(dāng)今高效快速的分離需求。毛細(xì)管內(nèi)壁與緩沖溶液的界面上形成雙電層,在高壓電場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)下形成定向運(yùn)動(dòng)的電滲流。如圖1a所示,帶電粒子根據(jù)自身的電泳力和電滲流力差異實(shí)現(xiàn)分離。毛細(xì)管電泳具有分析快速靈敏、樣品消耗量少、分離效率高等優(yōu)點(diǎn),在藥物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。將毛細(xì)管電泳技術(shù)與微流控技術(shù)聯(lián)用,即微流控芯片電泳是近年被廣泛應(yīng)用的一種新型分離技術(shù),具有低成本、分辨率高、快速等優(yōu)點(diǎn),被廣泛用于微納尺度物質(zhì)的分離分析中。Zhang等利用微流控芯片電泳技術(shù)對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌3種細(xì)菌進(jìn)行定量檢測(cè),有助于對(duì)人工污染的生食肉類中的致病菌進(jìn)行分析,結(jié)果顯示MCE技術(shù)具有靈敏度高、速度快、試劑消耗少和操作迅速等優(yōu)點(diǎn),是一種有效、可靠的食品安全評(píng)價(jià)方法。

Jeon等開發(fā)了一種基于壓力驅(qū)動(dòng)流誘導(dǎo)電泳的連續(xù)分離方法,如圖2a所示,在微流控裝置內(nèi),混合的微納尺度物質(zhì)受到來自流體的驅(qū)動(dòng)力、電滲流帶來的阻力和電泳力為主導(dǎo)的3種合力,根據(jù)其自身受電場(chǎng)影響下的電泳遷移率不同而進(jìn)行有效分離,分離效率可達(dá)97%。

蔡綺丹等為了驗(yàn)證阿霉素這一常用的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物是否與谷胱甘肽存在結(jié)合,利用微流控芯片電泳技術(shù)微型化集成化等優(yōu)點(diǎn)。如圖2b所示,利用簡(jiǎn)化的Hummel-Dreyer芯片毛細(xì)管電泳法,考察了阿霉素與還原性、氧化型谷胱甘肽的親和作用,最終得到了谷胱甘肽自身與阿霉素?zé)o親和作用這一結(jié)論,為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了理論支持。綜上所述,毛細(xì)管電泳技術(shù)與微流控技術(shù)的聯(lián)用在醫(yī)療、食品和生物等各個(gè)領(lǐng)域都有很大的發(fā)展前景。

圖2   基于微流控芯片電泳的分離系統(tǒng)

毛細(xì)管電泳技術(shù)與微流控技術(shù)的聯(lián)用同時(shí)具備毛細(xì)管電泳技術(shù)無標(biāo)記和對(duì)細(xì)胞等無損傷的優(yōu)勢(shì),聯(lián)用微流控技術(shù)的高效、微型化精準(zhǔn)分離,解決了傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳技術(shù)裝置繁瑣等問題,具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2 介電泳

介電泳由Pohl在20世紀(jì)50年代首次研究提出,指可極化粒子在非勻強(qiáng)電場(chǎng)中將會(huì)受到極化作用進(jìn)而產(chǎn)生偶極矩,偶極矩與非勻強(qiáng)電場(chǎng)之間產(chǎn)生介電泳力。粒子在該體系內(nèi)將會(huì)受到指向場(chǎng)最大的力正介電泳力,或者遠(yuǎn)離場(chǎng)的最大力負(fù)介電泳力,如圖1b所示。介電泳操縱粒子具有集成化、操作方便、成本低廉等優(yōu)勢(shì),已廣泛用于分離微顆粒和細(xì)胞。但是介電泳如果在強(qiáng)電場(chǎng)條件下對(duì)生物樣品進(jìn)行分離,則會(huì)導(dǎo)致生物樣品在電場(chǎng)內(nèi)受焦耳熱的影響直接死亡或產(chǎn)生不可逆的損傷。因此,利用微流控裝置產(chǎn)熱少、高通量和成本低等優(yōu)勢(shì),將介電泳技術(shù)與微流控技術(shù)聯(lián)用,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品無損和高效的分離。

為了解決多組分樣品的同時(shí)富集,Zhao等研制了一種新型微流控裝置,在直流介電泳提供的非勻強(qiáng)電場(chǎng)條件下,調(diào)節(jié)外加電場(chǎng)的電參數(shù)和流動(dòng)相懸浮液的電導(dǎo)率,實(shí)現(xiàn)對(duì)大小相近但介電特性不同的微納米混合顆粒物的分離。

Zhao等還制作了新型交流介電泳微流控芯片,芯片同時(shí)將兩個(gè)電極嵌在相對(duì)側(cè)壁上的一組不對(duì)稱孔內(nèi),使產(chǎn)生不均勻的電場(chǎng)。如圖3a所示,生物細(xì)胞等樣品通過微流控裝置內(nèi)時(shí),利用液聚焦使樣品在同一水平線移動(dòng),聚焦后的樣品進(jìn)入到DEP電場(chǎng)范圍內(nèi)時(shí),樣品受pDEP和nDEP的影響分別向兩側(cè)孔內(nèi)移動(dòng)。該實(shí)驗(yàn)研究了活酵母細(xì)胞和死酵母細(xì)胞在不同離子濃度、電導(dǎo)率、交流電場(chǎng)頻率下的DEP行為。與直流介電泳不同的是,該裝置利用調(diào)節(jié)交流電頻率、電壓等參數(shù),成功分離大小相近但介電常數(shù)不同的活酵母細(xì)胞和死酵母細(xì)胞。該微流控裝置制作簡(jiǎn)單,設(shè)計(jì)可以避免焦耳熱效應(yīng),且能誘導(dǎo)非均勻電場(chǎng)產(chǎn)生強(qiáng)梯度,可用于分離尺寸相近的納米顆粒。

圖3   基于介電泳技術(shù)的微流控分離系統(tǒng)

Kim等使用獨(dú)特的合成介電泳標(biāo)記來明確多種細(xì)胞類型,在微流控裝置的內(nèi)部通道結(jié)構(gòu)上放置兩個(gè)具有不同角度的傾斜電極,利用傾斜電極提供非均勻電場(chǎng),如圖3b所示。在非勻強(qiáng)電場(chǎng)下,混合樣品中不同尺寸的顆粒物在裝置內(nèi)產(chǎn)生的運(yùn)動(dòng)行為不同,實(shí)現(xiàn)了高分辨率和高吞吐量的分離效果。

Khoshmanesh等設(shè)計(jì)了一種非黏附的脂質(zhì)捕獲DEP系統(tǒng),如圖3c所示,利用光刻技術(shù)在玻璃基板上制備了DEP微電極陣列,避免了生物細(xì)胞的污染?；谛酒年嚵袘?yīng)用于捕獲人白血病細(xì)胞的環(huán)境掃描電子顯微鏡分析。這項(xiàng)工作驗(yàn)證了DEP細(xì)胞保留和捕獲技術(shù)。利用DEP芯片對(duì)人白血病細(xì)胞進(jìn)行捕獲,同時(shí)在ESEM上對(duì)單個(gè)非貼壁細(xì)胞進(jìn)行高分辨率分析,達(dá)到了造血腫瘤和干細(xì)胞的水動(dòng)力捕獲和長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)分析。

Sun等開發(fā)了一個(gè)具有自組裝液體電極的新型DEP微流控裝置,如圖3d所示。利用室溫離子液體形成的液體電極與DEP緩沖溶液耦合,再利用外部電場(chǎng)所施加的電壓,提高微流控芯片內(nèi)的電導(dǎo)率,產(chǎn)生電場(chǎng)梯度以對(duì)芯片內(nèi)的細(xì)胞與粒子進(jìn)行高效分離,利用自組裝的液體電極DEP微流控裝置成功分離聚苯乙烯珠與PC-3細(xì)胞、存活與凋亡的PC-3細(xì)胞以及人脂肪干細(xì)胞與MDA-MB-231癌細(xì)胞。該裝置具有成本低、分離效率高等優(yōu)點(diǎn),在細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)中具有巨大潛力。

Khamenehfar等利用介電泳對(duì)液體介質(zhì)中懸浮的可極化粒子具有可操縱性的特點(diǎn),制作了一種利用介電泳芯片的裝置,如圖3e所示。在微流控芯片通道內(nèi)部填充藍(lán)色使用染料,從左側(cè)的入口將細(xì)胞樣品注入,中間儲(chǔ)層用來藥物輸送,在電極產(chǎn)生的介電泳力作用下對(duì)骨髓性白細(xì)胞進(jìn)行捕獲。利用介電泳芯片裝置對(duì)單細(xì)胞分析,檢測(cè)多藥耐藥的藥物流出功能中單細(xì)胞的異質(zhì)性,并捕獲了具有MDR活性的白血病細(xì)胞和無MDR活性的白血病細(xì)胞,將其與良性白細(xì)胞區(qū)分。這對(duì)未來的醫(yī)療試驗(yàn)研究提供了一個(gè)確定單細(xì)胞水平上MDR抑制的異質(zhì)性新技術(shù)。

綜上所述,介電泳技術(shù)由于對(duì)尺寸相近且節(jié)點(diǎn)特性相差較小的微納尺度物質(zhì)分離不具有高分辨率,且傳統(tǒng)介電泳裝置存在高電壓條件下易對(duì)生物細(xì)胞造成損傷,同時(shí)有效電場(chǎng)較小,因此可將介電泳技術(shù)與微流控技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用,利用微流控技術(shù)裝置的小型化設(shè)計(jì),在低電壓條件下產(chǎn)生較高的有效電場(chǎng),對(duì)帶有不同尺寸、不同介電特性的混合樣品進(jìn)行精準(zhǔn)分離。

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