在靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中，蛋白質(zhì)是通過使用帶有傳感標(biāo)簽（如共軛熒光團、同位素標(biāo)簽或量子點）的親和探針進行分析的，這些探針會發(fā)射或轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。為了實現(xiàn)高靈敏度并促進單細胞水平的靶向蛋白質(zhì)組織學(xué)鑒定，微流體的使用越來越多，主要是因為它們提供了標(biāo)記過程中更高的有效濃度、可控的細胞操作、大大減少的試劑消耗以及提高多路復(fù)用性和吞吐量的設(shè)計靈活性等優(yōu)點。

基于細胞計量學(xué)的單細胞方法

流式細胞術(shù)（FCM）是一種標(biāo)準(zhǔn)的分析技術(shù)，通過量化單個細胞的熒光發(fā)射和散射光，每秒可以計數(shù)和分析數(shù)千個細胞。使用FCM和熒光抗體來分析細胞中的蛋白質(zhì)一直是生物科學(xué)的主流和廣泛應(yīng)用。然而，F(xiàn)CM的細胞內(nèi)空間信息有限，通常需要數(shù)十到數(shù)百μL的樣本量。當(dāng)將流式細胞儀縮小到微流體尺寸時，多參數(shù)測量的帶寬會受到損害，例如，在高通量設(shè)置（>2000個細胞/秒）下表征細胞形態(tài)是一項挑戰(zhàn)。為了解決這個問題，成像流式細胞術(shù)（IFC）結(jié)合了高通量FCM和高分辨率成像顯微鏡的優(yōu)勢，實現(xiàn)了細胞信息豐富的檢測（圖3a）。此外，IFC與微流體的集成允許簡單的光學(xué)實現(xiàn)和對細胞操作的精細控制。請注意，在大多數(shù)IFC微系統(tǒng)中，流體通量和光學(xué)檢測之間的權(quán)衡為在高通量下獲得體面的空間分辨率帶來了挑戰(zhàn)。為了解決這個問題，Holzner等人引入了使用多色熒光和亮場分析的多參數(shù)IFC，該方法能夠高分辨率和高通量地提取細胞形態(tài)特征，如準(zhǔn)確的細胞大小和檢測人類細胞中的細胞質(zhì)蛋白。該方法將頻閃照明（即一種為高速運動的物體生成無模糊圖像的技術(shù)）與彈性慣性3D細胞聚焦相結(jié)合，分別有效地控制流速和細胞定位，從而實現(xiàn)每秒104個細胞的采集率。

FCM的主要局限性之一源于從熒光標(biāo)記中檢索到的信號的光譜重疊。為了解決這個問題，Bandura等人引入了質(zhì)量細胞術(shù)（飛行時間細胞術(shù)（CyTOF）），該技術(shù)協(xié)同F(xiàn)CM和電感耦合質(zhì)譜（ICP-MS），用于同時免疫檢測單個細胞中約20種表面抗原。原則上，單細胞分析可以獲得多達100個參數(shù)，因為約100種同位素可用于標(biāo)記抗體。使用這種技術(shù)，細胞被用定制的多原子標(biāo)簽標(biāo)記的抗體進行免疫染色，然后提交給ICP-TOF-MS分析?；诒砻鏄?biāo)記，單細胞CyTOF用于識別人類造血連續(xù)體中的異質(zhì)性。 Porpiglia等人使用單細胞CyTOF對細胞表面標(biāo)記和肌源性轉(zhuǎn)化因子進行并發(fā)分析，從而能夠解決肌源性隔室的異質(zhì)性，并表征骨骼肌細胞中從干細胞到祖細胞的肌源性進展。為了解決DNA條形碼的表型和分辨率有限的問題，Wroblewska等人開發(fā)了一種條形碼系統(tǒng)，該系統(tǒng)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域運行,促進了高維單細胞CRISPR篩查。通過這種方法，通過合成模塊和編碼線性表位的三重組合，生成了100多種蛋白質(zhì)條形碼（Pro代碼）。隨后對Pro編碼轉(zhuǎn)染細胞的表達載體進行CyTOF分析，僅使用14種抗體即可檢測364個Pro編碼群體。CyTOF也用于鑒定臨床上重要的免疫重建。最近，Stern等人研究了人巨細胞病毒再激活不同階段免疫重建的演變變化，這是異基因造血干細胞移植后的主要并發(fā)癥。在這項研究中，CyTOF最大化了從有限樣本量（就細胞數(shù)量和血容量而言）中提取的數(shù)據(jù)容量。一般來說，CyTOF比FCM更有利于多路分析。由于檢測通道之間沒有重疊，由于對樣品基質(zhì)的獨立元素反應(yīng)，可以進行絕對定量。

同時，FCM和CyTOF在處理單細胞懸浮液進行熒光時會丟失關(guān)鍵的空間信息。為了解決這個問題，通過將質(zhì)譜儀擴展到成像質(zhì)譜儀（IMC），設(shè)計了組織樣本的單細胞分析，包括（但不限于）冷凍組織切片和福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織。 IMC應(yīng)用激光消融用同位素標(biāo)記抗體染色的組織或組織切片，用脈沖激光掃描和汽化，并在質(zhì)譜儀分析之前轉(zhuǎn)移到ICP-MS檢測。Jackson等人最近利用一個由35種生物標(biāo)志物組成的IMC小組來量化癌癥組織的臨床樣本。通過381張圖像中約8.55×105個細胞的標(biāo)記基因表達和單個細胞的空間特征，確定了腫瘤單細胞表型。單細胞IMC提供了空間分辨分析，這可能有助于研究表型異質(zhì)性及其在腫瘤結(jié)構(gòu)中的作用。目前，IMC面板的多路復(fù)用能力達到40個生物標(biāo)記。為了挖掘2D IMC中無法檢測到的信息，Kuett等人將空間分辨率擴展到3D，以便在TME中研究腫瘤侵襲。 Gerdtsson等人還證明了IMC與高清晰度單細胞分析（HD-SCA）檢測的整合，該檢測使用免疫熒光來表征沉積在載玻片上的數(shù)百萬白細胞中的罕見腫瘤細胞。通過使用IMC，對HD-SCA鑒定的CTC內(nèi)標(biāo)記的亞細胞定位進行了液體活檢的深入表型分析。

微蝕刻法

微重力法利用亞納升孔捕獲細胞，細胞分泌的蛋白質(zhì)被預(yù)處理的載玻片捕獲，載玻片上涂有親和探針（抗體或抗原）。Love等人開創(chuàng)了微重力生物芯片，其中微孔是通過沉積細胞懸浮液制備的，使細胞在去除多余的未被追蹤的細胞之前沉淀下來（圖3b）。然后將刻有抗體或抗原的載玻片貼在封閉的單細胞上，并通過熒光免疫測定法檢測分泌的蛋白質(zhì)。Schubert等人開發(fā)了一種單分子陣列（SiMoA）平臺，該平臺能夠?qū)蝹€細胞中的少量蛋白質(zhì)進行計數(shù)。SiMoA表明，前列腺特異性抗原的表達在前列腺癌癥細胞中不同，并隨著基因漂移而變化。Jia等人探索了微雕刻方法來研究非人靈長類動物對蛋白質(zhì)結(jié)合疫苗的縱向回憶反應(yīng)。自首次亮相以來，不斷努力提高微雕刻方法的靈敏度，推動了從單細胞中檢測低豐度蛋白質(zhì)。Li等人介紹了一種在蛋白質(zhì)檢測中使用微孔平臺的信號放大方法，其中光學(xué)的軸向分辨率（即深度場）得到了提高，側(cè)壁和邊緣捕獲的熒光標(biāo)簽也對信號做出了貢獻。與僅從平面發(fā)出熒光的傳統(tǒng)微重力方法相比，值得注意的是，邊緣增強微孔免疫測定將靈敏度提高了6倍。增強熒光的另一種方法是用半導(dǎo)體量子點代替有機染料，半導(dǎo)體量子點可用作熒光報告器來檢測單細胞分泌的蛋白質(zhì)。總之，基于微孔的檢測比傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附斑點（ELISpot）檢測具有更高的靈敏度。此外，這種方法還具有適用于下游分析的細胞分離等優(yōu)點，并能夠通過多抗體雕刻的載玻片對單細胞分泌體進行動力學(xué)研究。

基于條形碼的方法

希思小組開發(fā)的單細胞條形碼芯片（SCBC）是分析單細胞蛋白質(zhì)的首批基于條形碼的方法之一。在該系統(tǒng)中，單細胞通過微流體處理，并在觸發(fā)細胞分泌或裂解的微室中分離，目標(biāo)分析物被“條形碼陣列”捕獲并熒光檢測，其中各種DNA編碼的抗體被涂覆在玻璃基板的預(yù)定區(qū)域上（圖3c）。使用SCBC，從巨噬細胞和T細胞收集的10多種分泌蛋白的功能異質(zhì)性通過微環(huán)境激活進行表征。自SCBC引入以來，人們一直在努力提高其檢測性能，并擴展其在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的應(yīng)用。例如，SCBC的應(yīng)用通過獲得藥物狀態(tài)和藥物耐受狀態(tài)之間軌跡的時間分辨特征，揭示了藥物耐受的機制。Kravchenko-Balasha等人利用SCBC分析分離的膠質(zhì)母細胞瘤腦癌癥細胞的分泌蛋白。后來，多組學(xué)工作流程與SCBC整合：Xu等人測量轉(zhuǎn)錄物和裂解蛋白和Su等人通過與所選癌癥標(biāo)志物相關(guān)的細胞質(zhì)蛋白和代謝產(chǎn)物研究了細胞異質(zhì)性，這些標(biāo)志物在早期藥物反應(yīng)過程中功能發(fā)生了變化。最近，Wang等人介紹了一種使用氧化石墨烯量子點（GOQD）的單細胞多指數(shù)分泌生物標(biāo)志物分析方法；結(jié)果表明，GOQD組裝的底物導(dǎo)致抗體固定密度提高了2倍（與聚賴氨酸底物相比），背景噪聲降低了。多年來，SCBC已經(jīng)配備了不斷發(fā)展的微系統(tǒng)，導(dǎo)致多路復(fù)用性增加（>42種蛋白質(zhì)），吞吐量提高（>1000個細胞），熒光分辨率更高。

趙等人還介紹了另一種基于多重原位標(biāo)記（MIST）的條形碼功能SCP策略，其中可以分析單細胞中的數(shù)十至數(shù)百個分子靶點。為此，在載玻片上對單層ssDNA-編碼微珠進行圖案化，與互補的DNA-抗體偶聯(lián)物雜交，然后用含有單細胞的PDMS微孔封閉。通過熒光夾心ELISA，然后分析每種珠子，以檢測數(shù)千個陣列中的特定蛋白質(zhì)。這種方法的后續(xù)發(fā)展導(dǎo)致了單細胞循環(huán)多重原位標(biāo)記（CycMIST）平臺的出現(xiàn)，在該平臺中，使用紫外線可切割的DNA條形碼抗體來實現(xiàn)多輪標(biāo)記和多循環(huán)解碼過程，以實現(xiàn)高通量和靈敏度。高密度DNA陣列和小尺寸微孔的聯(lián)合作用允許從單個細胞中檢測到約180個蛋白質(zhì)拷貝。

微流控毛細管電泳和單細胞蛋白質(zhì)印跡

毛細管電泳（CE）是一種分析方法，其特點是使用高電場進行高分離效率和靈敏的離子檢測。傳統(tǒng)的CE存在分離時間長、樣品消耗大和焦耳熱耗散慢的問題。另一方面，微流體CE（MCE）能夠解決這些局限性。MCE使用微通道在納升尺度上對生物分子進行電泳分離，分析時間需要數(shù)十秒，可用于分離和檢測從單細胞中提取的細胞內(nèi)內(nèi)容物。Huang等人開發(fā)了一種MCE，通過使用單分子熒光測量來檢測單細胞中的低拷貝數(shù)（LCN）蛋白質(zhì)。請注意，這種方法的吞吐量相對較低，多路復(fù)用能力有限。為了提高通量，Mainz等人利用光可編程和細胞可滲透的報告器同時分析單個細胞的激酶活性。Li等人還提出了一種基于多色熒光檢測的微流體裝置，用于單細胞操作，該裝置提供了有效的電泳分離，以實現(xiàn)多個小分子的同時檢測?？傮w而言，MCE利用短距離和相對較短的時間尺度，可以快速完成傳統(tǒng)CE中采取的所有步驟。

微流體中使用的另一種電泳方法是A.Herr小組開發(fā)的單細胞蛋白質(zhì)印跡（scWB），其中特定蛋白質(zhì)的鑒定和定量取決于它們通過與抗體探針結(jié)合的薄層凝膠基質(zhì)的遷移（圖3d）。 scWB將蛋白質(zhì)印跡與開放式微孔陣列相結(jié)合，從而提高了檢測通量，并能夠可靠地處理約2000個神經(jīng)干細胞。請注意，scWB的早期發(fā)展主要集中在處理大量輸入細胞，例如>1000個輸入細胞，因此無法處理質(zhì)量有限的輸入細胞。為了解決這個問題，Sinkala等人將稀有細胞工作流程與scWB相結(jié)合，以分析單個循環(huán)腫瘤細胞（CTC）的蛋白質(zhì)表達（復(fù)雜性=8）。具體來說，從患者血液中收集的細胞根據(jù)大小和變形性進行選擇，對大有核細胞進行染色和鑒定，然后轉(zhuǎn)移到微孔中。然后裂解這些細胞，將相關(guān)蛋白電泳注射到凝膠中，依次進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、印跡和免疫印跡步驟。最近，差異分級被整合到電泳分離中：特別是，J.Vlassakis等人通過電泳和免疫測定讀數(shù)（SIFTER）引入了單細胞蛋白質(zhì)相互作用分級，用于定量單細胞中的多聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物。在這項工作中，進行了雙向電泳，單體和解聚的蛋白質(zhì)復(fù)合物被分級并固定在微孔周圍的凝膠區(qū)域，然后使用凝膠內(nèi)免疫探針進行定量。除了高通量和負擔(dān)得起的多重性的優(yōu)點外，scWB還由于電泳分離而提高了抗體的特異性。

液滴微流體

液滴微流體技術(shù)能夠通過在納升體積的液滴中用熒光探針進行液滴包封來定量單個細胞釋放的分泌體，克服了微流體FCM無法檢測分泌蛋白的技術(shù)限制。液滴微流控技術(shù)也被用于分析細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，其中一到三個細胞在液滴形成之前被電裂解。丁等人最近使用共流液滴微流技術(shù)將原代細胞（取自組織）與捕獲微珠和熒光標(biāo)記抗原一起包封（圖3e）。在液滴培養(yǎng)過程中，所需的細胞（如B細胞）分泌第一抗體，以介導(dǎo)熒光團標(biāo)記的抗原與微珠之間的結(jié)合。隨后，通過熒光信號對被熒光抗原“標(biāo)記”的所需液滴進行分選（圖3e）。液滴微流控方法可實現(xiàn)高通量分析；然而，檢測珠（在焦平面上）的排列使得對分泌的抗體進行定量變得具有挑戰(zhàn)性。為了解決這個問題，通過在液滴產(chǎn)生后將熱固性油的包封轉(zhuǎn)化為固體來證明液滴的固定化。另一方面，Eyer等人引入了一種基于液滴的微流體技術(shù)（DropMAP），從固定在2D陣列上的液滴中引出單細胞分析。DropMAP能夠?qū)崟r測量以量化抗體分泌率、免疫親和性和相關(guān)動力學(xué)。關(guān)于DropMAP的工作原理，包封了兩個水相，其中一個包含細胞或校準(zhǔn)抗體，另一個包含試劑（熒光標(biāo)記和300 nm順磁性納米顆粒）。由于使用了納米顆粒，抗體的結(jié)合能力得到了提高。當(dāng)施加磁場時，納米粒子（旨在捕獲分泌的免疫球蛋白）交聯(lián)，形成微米大小的聚集體。為了促進單個細胞在液滴內(nèi)的封裝并提高多路復(fù)用性，Khajvand等人將液滴微流體與抗體條形碼集成在一起。使用約180 pL大小的腔室陣列來提高單細胞捕獲效率（超過80%，存活率>90%），這種方法大大提高了固定液滴中單細胞的片上捕獲、分離和長期培養(yǎng)。一般來說，基于液滴的微流體具有快速包封、提高靶濃度、減少樣品之間的交叉污染以及橋接基因型和表型的能力。

總之，迄今為止討論的微流體耦合靶向SCP方法清楚地展示了它們在推動基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究的關(guān)鍵生物學(xué)理解方面的潛力。盡管基于靶向的SCP方法由于需要親和標(biāo)記而具有內(nèi)在局限性，但微流體和超靈敏生物傳感方法的協(xié)同協(xié)調(diào)可能會補充基于MS的全局SCP不足的LCN蛋白質(zhì)組領(lǐng)域。由于不存在一刀切的儀器，因此應(yīng)從靶向和全局SCP交替檢索的綜合圖譜應(yīng)結(jié)合在一起，以說明基因組和相關(guān)蛋白質(zhì)組之間的未知變異。

免責(zé)聲明:文章來源網(wǎng)絡(luò)以傳播知識、有益學(xué)習(xí)和研究為宗旨。轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請聯(lián)系刪除。